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05.02.2025 09:42

Was heißt hier „Auflösung“? Mikroskopie-Rätsel gelöst

Dr. Florian Aigner PR und Marketing
Technische Universität Wien

Ein neues Mikroskopie-Verfahren kann Moleküle identifizieren. Die Frage nach dem Auflösungsvermögen erwies sich aber als schwieriges Rätsel. An der TU Wien wurde es nun gelöst.

Wenn man die Qualität eines Mikroskops beurteilt, ist die entscheidende Frage: Wie groß sind die kleinsten Strukturen, die man damit gerade noch sichtbar machen kann? Wie nah können zwei Objekte aneinanderrücken, bis sie nicht mehr als zwei getrennte Objekte zu sehen sind, sondern zu einem einzigen Bild-Blob verschwimmen?

Bei gewöhnlichen Lichtmikroskopen lässt sich das mit relativ einfachen Formeln berechnen. Doch mittlerweile verwendet man in vielen Bereichen komplizierte Mikroskopie-Techniken, bei denen diese Frage viel schwieriger zu beantworten ist.

Eine davon ist die Rasterkraftmikroskopie-Infrarotspektroskopie (AFM-IR), mit der man die Verteilung von chemischen Stoffen abbilden kann. Man kann mit dieser Methode zum Beispiel Proteine in einer Zelle identifizieren und sichtbar machen. Doch wie gut diese Methode in welcher Situation funktioniert, war bisher oft unklar. Das Auflösungsvermögen der Methode variiert und hängt auf komplizierte Weise von vielen verschiedenen Effekten ab. An der TU Wien gelang es nun, diese Effekte zu beschreiben und das Auflösungsvermögen solcher Mikroskope zu berechnen. Was man bisher nur durch Ausprobieren herausfinden konnte, lässt sich nun zuverlässig vorhersagen.

Rasterkraftmikroskope und Infrarotstrahlung

Die Mikroskopie-Technik AFM-IR wird bereits seit einigen Jahren an der TU Wien beforscht. Sie verbindet Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy – AFM) mit Infrarot-Spektroskopie (IR).

Um große Moleküle wie beispielsweise Proteine aufzuspüren, kann man Infrarotstrahlung verwenden: Unterschiedliche Moleküle reagieren auf unterschiedliche Infrarot-Wellenlängen. Durch Messung bei vielen unterschiedlichen Infrarot-Wellenlängen ergibt sich ein sogenanntes Infrarotspektrum – so etwas wie der Fingerabdruck eines Moleküls. An diesem Spektrum lässt sich erkennen, mit welchem Molekül man es zu tun hat.

„Allerdings weiß man dann noch nicht, wo sich dieses Molekül genau befindet“, sagt Prof. Georg Ramer vom Institut für Chemische Technologien und Analytik der TU Wien. Man kann aber diese Infrarot-Methode mit einem Rasterkraftmikroskop kombinieren. Dabei tastet man die Oberfläche der Probe mit einer sehr feinen Spitze ab. Wenn an einer bestimmten Stelle ein Molekül sitzt, das gerade Infrarotstrahlung aufnimmt, dann führt das genau an dieser Stelle zu einer lokalen Erwärmung. Die Probe dehnt sich ein bisschen aus, und das lässt sich mit dem Rasterkraftmikroskop messen. Man weiß dann also nicht nur, um welches Molekül es sich handelt, sondern auch ganz genau, wo es sitzt.

Die genaue Auflösung? Ein Rätsel

„Viele Forscher und Firmen verwenden diese Methode mit Erfolg, weil sie mit sehr hoher Auflösung sagen kann, wo welche Moleküle sitzen. Sie hatte aber bisher so etwas wie ein schmutziges Geheimnis“, sagt Georg Ramer. „Niemand konnte sagen, wie hoch die Ortsauflösung der Technik ist. Die Antworten, die man dazu in der Literatur findet – 10 Nanometer oder auch 100 Nanometer – sind selten wirklich fundiert, sondern eher geraten.“ Nicht immer funktioniert die Methode gleich gut, sie ist von Probe zu Probe unterschiedlich.

Das ist ein Problem, denn wenn man das Auflösungsvermögen nicht kennt, kann man auch nicht sagen, für welche Anwendungen die Methode eingesetzt werden kann. Man führt möglicherweise Experimente durch, für die diese Technik eigentlich gar nicht geeignet ist.

„Wir haben uns das näher angesehen und sowohl Experimente durchgeführt als auch Rechenmodelle und Computersimulationen entwickelt“, sagt Yide Zhang, einer der beiden Doktoranden, die an dem Projekt arbeiten. „So können wir nun endlich genau erklären, warum es zu diesem merkwürdigen Effekt kommt, dass die Auflösung manchmal besser und manchmal schlechter ist.“

Wenn ein Molekül auf der Probe Infrarotlicht absorbiert und sich erwärmt, führt das nicht immer zur gleichen gemessenen Ausdehnung.  Diese Ausdehnung hängt nämlich auch davon ab, wie schnell die Wärme abgeleitet wird und wieviel Material sich zwischen dem Molekül und der Spitze des Instruments befindet. Mit dem neuen Computermodell lässt sich ausrechnen, wie stark welche Probe auf diesen Wärmeeffekt reagiert, und in welchen konkreten Fällen dieser Effekt sichtbar sein sollte und in welchen nicht.

Mehr über die Probe lernen als je zuvor

„Unsere Ergebnisse können nun verwendet werden, um im Vorhinein zu entscheiden, ob ein bestimmtes Experiment mit der Methode überhaupt Sinn macht“, sagt Georg Ramer. „Und nicht nur das: Unsere Arbeit erlaubt uns auch, Experimente korrekter zu interpretieren und Empfindlichkeit und Auflösung zu optimieren.“ So wurde bisher die Probe etwa meist als zweidimensionale Oberfläche betrachtet. Mit den neuen Erkenntnissen lassen sich nun aber auch Aussagen über die dritte Dimension machen: Man kann nun also ein 3D-Bild der Probe auf Nanometer-Skala erstellen.

Wenn man die Qualität eines Mikroskops beurteilt, ist die entscheidende Frage: Wie groß sind die kleinsten Strukturen, die man damit gerade noch sichtbar machen kann? Wie nah können zwei Objekte aneinanderrücken, bis sie nicht mehr als zwei getrennte Objekte zu sehen sind, sondern zu einem einzigen Bild-Blob verschwimmen?

Bei gewöhnlichen Lichtmikroskopen lässt sich das mit relativ einfachen Formeln berechnen. Doch mittlerweile verwendet man in vielen Bereichen komplizierte Mikroskopie-Techniken, bei denen diese Frage viel schwieriger zu beantworten ist.

Eine davon ist die Rasterkraftmikroskopie-Infrarotspektroskopie (AFM-IR), mit der man die Verteilung von chemischen Stoffen abbilden kann. Man kann mit dieser Methode zum Beispiel Proteine in einer Zelle identifizieren und sichtbar machen. Doch wie gut diese Methode in welcher Situation funktioniert, war bisher oft unklar. Das Auflösungsvermögen der Methode variiert und hängt auf komplizierte Weise von vielen verschiedenen Effekten ab. An der TU Wien gelang es nun, diese Effekte zu beschreiben und das Auflösungsvermögen solcher Mikroskope zu berechnen. Was man bisher nur durch Ausprobieren herausfinden konnte, lässt sich nun zuverlässig vorhersagen.

Rasterkraftmikroskope und Infrarotstrahlung

Die Mikroskopie-Technik AFM-IR wird bereits seit einigen Jahren an der TU Wien beforscht. Sie verbindet Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy – AFM) mit Infrarot-Spektroskopie (IR).

Um große Moleküle wie beispielsweise Proteine aufzuspüren, kann man Infrarotstrahlung verwenden: Unterschiedliche Moleküle reagieren auf unterschiedliche Infrarot-Wellenlängen. Durch Messung bei vielen unterschiedlichen Infrarot-Wellenlängen ergibt sich ein sogenanntes Infrarotspektrum – so etwas wie der Fingerabdruck eines Moleküls. An diesem Spektrum lässt sich erkennen, mit welchem Molekül man es zu tun hat.

„Allerdings weiß man dann noch nicht, wo sich dieses Molekül genau befindet“, sagt Prof. Georg Ramer vom Institut für Chemische Technologien und Analytik der TU Wien. Man kann aber diese Infrarot-Methode mit einem Rasterkraftmikroskop kombinieren. Dabei tastet man die Oberfläche der Probe mit einer sehr feinen Spitze ab. Wenn an einer bestimmten Stelle ein Molekül sitzt, das gerade Infrarotstrahlung aufnimmt, dann führt das genau an dieser Stelle zu einer lokalen Erwärmung. Die Probe dehnt sich ein bisschen aus, und das lässt sich mit dem Rasterkraftmikroskop messen. Man weiß dann also nicht nur, um welches Molekül es sich handelt, sondern auch ganz genau, wo es sitzt.

Die genaue Auflösung? Ein Rätsel

„Viele Forscher und Firmen verwenden diese Methode mit Erfolg, weil sie mit sehr hoher Auflösung sagen kann, wo welche Moleküle sitzen. Sie hatte aber bisher so etwas wie ein schmutziges Geheimnis“, sagt Georg Ramer. „Niemand konnte sagen, wie hoch die Ortsauflösung der Technik ist. Die Antworten, die man dazu in der Literatur findet – 10 Nanometer oder auch 100 Nanometer – sind selten wirklich fundiert, sondern eher geraten.“ Nicht immer funktioniert die Methode gleich gut, sie ist von Probe zu Probe unterschiedlich.

Das ist ein Problem, denn wenn man das Auflösungsvermögen nicht kennt, kann man auch nicht sagen, für welche Anwendungen die Methode eingesetzt werden kann. Man führt möglicherweise Experimente durch, für die diese Technik eigentlich gar nicht geeignet ist.

„Wir haben uns das näher angesehen und sowohl Experimente durchgeführt als auch Rechenmodelle und Computersimulationen entwickelt“, sagt Yide Zhang, einer der beiden Doktoranden, die an dem Projekt arbeiten. „So können wir nun endlich genau erklären, warum es zu diesem merkwürdigen Effekt kommt, dass die Auflösung manchmal besser und manchmal schlechter ist.“

Wenn ein Molekül auf der Probe Infrarotlicht absorbiert und sich erwärmt, führt das nicht immer zur gleichen gemessenen Ausdehnung.  Diese Ausdehnung hängt nämlich auch davon ab, wie schnell die Wärme abgeleitet wird und wieviel Material sich zwischen dem Molekül und der Spitze des Instruments befindet. Mit dem neuen Computermodell lässt sich ausrechnen, wie stark welche Probe auf diesen Wärmeeffekt reagiert, und in welchen konkreten Fällen dieser Effekt sichtbar sein sollte und in welchen nicht.

Mehr über die Probe lernen als je zuvor

„Unsere Ergebnisse können nun verwendet werden, um im Vorhinein zu entscheiden, ob ein bestimmtes Experiment mit der Methode überhaupt Sinn macht“, sagt Georg Ramer. „Und nicht nur das: Unsere Arbeit erlaubt uns auch, Experimente korrekter zu interpretieren und Empfindlichkeit und Auflösung zu optimieren.“ So wurde bisher die Probe etwa meist als zweidimensionale Oberfläche betrachtet. Mit den neuen Erkenntnissen lassen sich nun aber auch Aussagen über die dritte Dimension machen: Man kann nun also ein 3D-Bild der Probe auf Nanometer-Skala erstellen.

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Wissenschaftliche Ansprechpartner:

Prof. Georg Ramer
Institut für Chemische Technologien und Analytik
Technische Universität Wien
+43 1 58801 164151
georg.ramer@tuwien.ac.at

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Originalpublikation:

Y. Zhang et al., An analytical model of label-free nanoscale chemical imaging reveals avenues toward improved spatial resolution and sensitivity, PNAS 122 (4) e2403079122 (2025).

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Georg Ramer
TU Wien
TU Wien

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Merkmale dieser Pressemitteilung:
Journalisten, jedermann
Chemie, Physik / Astronomie
überregional
Forschungsergebnisse
Deutsch

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